IPTG (ஐசோபுரோப்பைல்-β-D-தியோகலக்டோசைடு) என்பது β-கலக்டோசிடேஸ் அடி மூலக்கூறின் ஒரு ஒப்புரு ஆகும், இது அதிக அளவில் தூண்டப்படக்கூடியது. IPTG-யின் தூண்டுதலின் கீழ், தூண்டியானது அடக்கிப் புரதத்துடன் ஒரு சிக்கலான அமைப்பை உருவாக்க முடியும். அதனால், அடக்கிப் புரதத்தின் உருவமைப்பு மாற்றப்படுகிறது, இதனால் அது இலக்கு மரபணுவுடன் இணைய முடியாது, மேலும் இலக்கு மரபணு திறமையாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. எனவே, பரிசோதனையின் போது IPTG-யின் செறிவை எவ்வாறு தீர்மானிக்க வேண்டும்? செறிவு அதிகமாக இருப்பது சிறந்ததா?
முதலில், IPTG தூண்டலின் கொள்கையைப் புரிந்துகொள்வோம்: ஈ. கோலையின் லாக்டோஸ் ஓபரான் (கூறு) Z, Y, மற்றும் A என்ற மூன்று கட்டமைப்பு மரபணுக்களைக் கொண்டுள்ளது, அவை முறையே β-கேலக்டோசிடேஸ், பெர்மீயேஸ் மற்றும் அசிடைல்டிரான்ஸ்ஃபெரேஸ் ஆகியவற்றை குறியீடு செய்கின்றன. lacZ, லாக்டோஸை குளுக்கோஸ் மற்றும் கேலக்டோஸாகவோ அல்லது அல்லோ-லாக்டோஸாகவோ நீராற்பகுக்கிறது; lacY, சுற்றுச்சூழலில் உள்ள லாக்டோஸை செல் சவ்வின் வழியாகச் சென்று செல்லுக்குள் நுழைய அனுமதிக்கிறது; lacA, அசிடைல்-CoA-விலிருந்து அசிடைல் குழுவை β-கேலக்டோசைடுக்கு மாற்றுகிறது, இது நச்சு விளைவை நீக்குவதை உள்ளடக்கியது. கூடுதலாக, ஒரு இயக்க வரிசை O, ஒரு தொடக்க வரிசை P மற்றும் ஒரு ஒழுங்குபடுத்தும் மரபணு I ஆகியவை உள்ளன. I மரபணு குறியீடு ஒரு அடக்கிப் புரதமாகும், இது இயக்க வரிசையின் O நிலையில் பிணைக்க முடியும், அதனால் ஓபரான் (மெட்டா) அடக்கப்பட்டு அணைக்கப்படுகிறது. தொடக்க வரிசை P-க்கு முன்பாக, சிதைவு மரபணு செயலூக்கிப் புரதத்திற்கான (CAP) ஒரு பிணைப்புத் தளமும் உள்ளது. P வரிசை, O வரிசை மற்றும் CAP பிணைப்புத் தளம் ஆகிய மூன்றும் சேர்ந்து லாக் ஓபரானின் ஒழுங்குபடுத்தும் பகுதியை உருவாக்குகின்றன. மரபணு விளைபொருட்களின் ஒருங்கிணைந்த வெளிப்பாட்டை அடைவதற்காக, மூன்று நொதிகளின் குறியீட்டு மரபணுக்களும் இதே ஒழுங்குபடுத்தும் பகுதியால் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன.
லாக்டோஸ் இல்லாத நிலையில், லாக் ஓபரான் (மெட்டா) ஒடுக்க நிலையில் உள்ளது. இந்த நேரத்தில், PI புரோமோட்டர் வரிசையின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் I வரிசையால் வெளிப்படுத்தப்படும் லாக் ரெப்ரசர், O வரிசையுடன் பிணைந்து, RNA பாலிமரேஸ் P வரிசையுடன் பிணைவதைத் தடுத்து, படியெடுத்தல் தொடக்கத்தைத் தடுக்கிறது; லாக்டோஸ் இருக்கும்போது, லாக் ஓபரான் (மெட்டா) தூண்டப்படலாம். இந்த ஓபரான் (மெட்டா) அமைப்பில், உண்மையான தூண்டி லாக்டோஸ் அல்ல. லாக்டோஸ் செல்லுக்குள் நுழைந்து, β-கேலக்டோசிடேஸால் வினையூக்கப்பட்டு அல்லோலாக்டோஸாக மாற்றப்படுகிறது. பிந்தையது, ஒரு தூண்டி மூலக்கூறாக, ரெப்ரசர் புரதத்துடன் பிணைந்து, புரதத்தின் வடிவத்தை மாற்றுகிறது, இது ரெப்ரசர் புரதத்தை O வரிசையிலிருந்து பிரித்து படியெடுத்தலுக்கு வழிவகுக்கிறது. ஐசோபுரோப்பைல்தியோகேலக்டோசைடு (IPTG) அல்லோலாக்டோஸைப் போன்ற அதே விளைவைக் கொண்டுள்ளது. இது மிகவும் சக்திவாய்ந்த தூண்டியாகும், இது பாக்டீரியாவால் வளர்சிதை மாற்றம் செய்யப்படுவதில்லை மற்றும் மிகவும் நிலையானது, எனவே இது ஆய்வகங்களில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
IPTG-யின் உகந்த செறிவை எவ்வாறு கண்டறிவது? ஈ. கோலையை உதாரணமாக எடுத்துக்கொள்வோம்.
நேர்மறை மறுசேர்க்கை pGEX (CGRP/msCT) ஐக் கொண்ட E. coli BL21 மரபணு மாற்றப்பட்ட திரிபு, 50μg·mL-1 ஆம்ப் கொண்ட LB திரவ ஊடகத்தில் இடப்பட்டு, 37°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் வளர்க்கப்பட்டது. விரிவாக்க வளர்ப்பிற்காக, மேற்கண்ட வளர்ப்பு, 50μg·mL-1 ஆம்ப் கொண்ட 50mL புதிய LB திரவ ஊடகத்தின் 10 குப்பிகளில் 1:100 என்ற விகிதத்தில் இடப்பட்டது. மேலும், OD600 மதிப்பு 0.6~0.8 ஆக இருந்தபோது, IPTG இறுதிச் செறிவுக்கு சேர்க்கப்பட்டது. அந்தச் செறிவுகள் 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ஆகும். அதே வெப்பநிலை மற்றும் அதே நேரத்தில் தூண்டப்பட்ட பிறகு, அதிலிருந்து 1 மிலி பாக்டீரியா கரைசல் எடுக்கப்பட்டு, பாக்டீரியா செல்கள் மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு, புரத வெளிப்பாட்டின் மீது வெவ்வேறு IPTG செறிவுகளின் தாக்கத்தை பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக SDS-PAGEக்கு உட்படுத்தப்பட்டன, பின்னர் அதிகபட்ச புரத வெளிப்பாட்டைக் கொண்ட IPTG செறிவு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.
சோதனைகளுக்குப் பிறகு, IPTG-யின் செறிவு முடிந்தவரை அதிகமாக இருக்கக்கூடாது என்பது தெரியவரும். இதற்குக் காரணம், IPTG பாக்டீரியாக்களுக்கு ஒரு குறிப்பிட்ட நச்சுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதுதான். செறிவை மீறினால் அதுவும் செல்லைக் கொன்றுவிடும்; பொதுவாகச் சொல்வதானால், செல்லில் எவ்வளவு அதிகமாகக் கரையக்கூடிய புரதம் வெளிப்படுகிறதோ, அவ்வளவு நல்லது என்று நாம் நம்புகிறோம். ஆனால் பல சமயங்களில், IPTG-யின் செறிவு மிக அதிகமாக இருக்கும்போது, செல்லுக்குள் அதிக அளவில் உட்பொருட்கள் உருவாகின்றன, ஆனால் கரையக்கூடிய புரதத்தின் அளவு குறைந்துவிடுகிறது. எனவே, மிகவும் பொருத்தமான IPTG செறிவு என்பது, செறிவு எவ்வளவு அதிகமாக இருக்கிறதோ அவ்வளவு நல்லது என்பதல்ல, மாறாக, செறிவு எவ்வளவு குறைவாக இருக்கிறதோ அவ்வளவு நல்லது என்பதே ஆகும்.
மரபணு மாற்றப்பட்ட திரிபுகளைத் தூண்டி வளர்ப்பதன் நோக்கம், இலக்குப் புரதத்தின் விளைச்சலை அதிகரிப்பதும் செலவுகளைக் குறைப்பதுமாகும். இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாடானது, திரிபின் சொந்தக் காரணிகள் மற்றும் வெளிப்பாட்டு பிளாஸ்மிட் ஆகியவற்றால் மட்டுமல்லாமல், தூண்டியின் செறிவு, தூண்டல் வெப்பநிலை மற்றும் தூண்டல் நேரம் போன்ற பிற வெளிப்புற நிலைமைகளாலும் பாதிக்கப்படுகிறது. எனவே, பொதுவாக, ஒரு அறியப்படாத புரதத்தை வெளிப்படுத்தி தூய்மைப்படுத்துவதற்கு முன்பு, பொருத்தமான நிலைமைகளைத் தேர்ந்தெடுத்து சிறந்த சோதனை முடிவுகளைப் பெறுவதற்காக, தூண்டல் நேரம், வெப்பநிலை மற்றும் IPTG செறிவு ஆகியவற்றை ஆய்வு செய்வது சிறந்தது.
பதிவிட்ட நேரம்: டிசம்பர் 31, 2021